Preparación de muestras para microscopio óptico

La preparación de la muestra para el microscopio es un paso esencial para llevar a cabo una observación exitosa.

El proceso adecuado de preparación depende siempre de la muestra y debe tener en cuenta el tipo de detalles que se quieren observar.

Para ello es necesario saber si observaremos una muestra viva o muerta, si queremos ver la muestra entera o simplemente una sección y si será necesario utilizar tintes para poner de relieve una característica concreta.

También es importante conocer la duración de la observación ya que esto determina si será necesario hidratar la muestra para evitar que se seque.

Si conocemos la respuesta a estas preguntas podremos saber cómo preparar una muestra con el contraste adecuado para observar las características y los detalles que nos interesan.

Aparte de una buena preparación también es indispensable disponer de un microscopio con el aumento necesario para observar los detalles en cuestión.


La explicación de este artículo asume que estamos interesados en una observación mediante microscopio de luz transmitida. En estos casos la luz del microscopio atraviesa la muestra y para ello es necesario preparar la muestra con un espesor mínimo.

Si el espesor de la muestra es excesivo no hay suficiente luz que pase a través suyo y los detalles permanecerán oscuros.

Este tipo de observación es una de las más habituales y requiere preparar una muestra en el portaobjetos. Es el tipo de observación que se utiliza para muestra biológicas, ya sean vivas o muertas.

Una observación alternativa es la de los microscopios de luz reflejada. En este caso la luz llega a la muestra y es reflejada hacia el ocular, a través del cual puede ser observada. Este tipo de observación se utiliza para observar materiales como, por ejemplo, superficies metálicas.


Material necesario para preparar la muestra

El primer paso antes de empezar a preparar una muestra es asegurarnos de que disponemos de todo el material que necesitaremos. Esto incluye siempre un portaobjetos y un cubreobjetos. Dependiendo del tipo de muestra, también necesitaremos unos pinzas para su manipulación.

En la mayoría de los casos necesitaremos también una pipeta para hidratar la muestra y probablemente un tinte y papel absorbente.

Portaobjetos

El portaobjetos es una pequeña pieza de vidrio con unas dimensiones de aproximadamente 76 x 26 mm y entre 1 y 1.5 milímetros de espesor. Su función es servir de soporte para la muestra ya que es sobre él que colocaremos el espécimen que queremos observar.

Es importante manipular con cuidado el portaobjetos ya que sus cantos afilados pueden en ocasiones producir cortes. Para evitar lesiones existen portaobjetos con las esquinas esmeriladas.

Existen dos tipos de portaobjetos. Los más habituales son totalmente planos en sus dos caras. Estos portaobjetos son adecuados si no se necesita una especial cantidad de agua en la que sumergir la muestra.

También existen portaobjetos con una cavidad cóncava, conocidos también como portaobjetos excavados. Estos portaobjetos son adecuados para retener una mayor cantidad de líquido y sirven para mantener la muestra hidratada durante más tiempo. También son adecuados para observar muestras de mayores dimensiones y no requieren el uso de cubreobjetos.

Cubreobjetos

El cubreobjetos es también una pequeña pieza de vidrio con unas dimensiones menores que el portaobjetos. El cubreobjetos tiene una forma cuadrada con un lado de entre 18 y 20 milímetros y un espesor de entre 0.13 y 0.17 mm.

Debido a su espesor extremadamente bajo, el cubreobjetos es un elemento extremadamente frágil y, por lo tanto, hay que manipularlo con cuidado.

La función del cubreobjetos es mantener la muestra en su sitio y protegerla de posibles contaminaciones. Además, es también una medida de protección para evitar que la lente del objetivo entre en contacto con la muestra.

Durante la preparación de la muestra es habitual añadir unas gotas de agua sobre la muestra. La colocación del cubreobjetos sobre estas gotas de agua permite aplanar el líquido y facilita el enfoque sobre el plano de la muestra.

Pipeta

La pipeta es un instrumento de laboratorio que permite medir y dosificar un líquido con gran precisión. En el campo de la microscopía se utiliza para colocar sobre la muestra la cantidad de líquido adecuada para su hidratación o simplemente para colocar sobre el portaobjetos una cantidad limitada de líquido que contiene la muestra.

Tinte y papel absorbente

La tinción es uno de los recursos utilizados para poner de relieve algunas características concretas de la muestra observada. Existe una gran cantidad de técnicas de tinción y su uso en cada caso depende de la muestra observada.

En los procesos de tinción se utilizan colorantes y tinturas que se mezclan con la muestra para mostrar estructuras que de otro modo permanecerían invisibles.

Una distinción importante es entre la tinción in vivo, que incluye las técnicas para teñir células vivas, y la tinción in vitro, que se refiere a las técnicas para teñir células muertas.

Cuando se utilizan tintes es habitual utilizar también papel absorbente para deshacerse de un posible exceso de tinte sobre el portaobjetos.

Pasos para preparar una muestra

Existen dos formas básicas de preparar una muestra para el microscopio: la preparación en fresco o húmeda y la preparación en seco.

Preparación en fresco

La preparación en fresco es ideal para la observación de microorganismos o de tejidos biológicos que requieren ser hidratados.

  1. Si la muestra es líquida colocamos unas gotas de la muestra en el centro del portaobjetos con la ayuda de una pipeta.
  2. Si la muestra es sólida colocamos primero unas gotas de agua destilada o de solución salina sobre el portaobjetos y a continuación un fragmento de la muestra con la ayuda de unas pinzas.
  3. Sujetando el cubreobjetos por dos de sus lados, apoyamos otro de sus lados sobre el portaobjetos de modo que forme un ángulo de aproximadamente 45 grados.
  4. A continuación podemos soltar con cuidado el cubreobjetos de modo que quede colocado sobre el líquido que hemos depositado anteriormente. (Mediante este procedimiento se evita la formación de burbujas dentro de la muestra. En caso de que hayan aparecido burbujas entre el portaobjetos y el cubreobjetos será necesario repetir el procedimiento anterior.)
  5. En caso de que haya un exceso de líquido alrededor del cubreobjetos podemos eliminarlo mediante papel absorbente.

Las preparaciones en fresco mantienen la hidratación durante un periodo de aproximadamente 30 minutos.

Si se requiere mantener la muestra hidratada durante un espacio de tiempo más largo pueden sellarse los bordes del cubreobjetos con vaselina. En este caso se evita la evaporación del líquido durante unas horas o incluso unos días.

Preparación en seco

La preparación en seco es ideal para muestras que no necesitan hidratación. Esto incluye, por ejemplo, un cabello, granos de polen, esporas, muestras de plantas, insectos, etc.

  1. Si la muestra es totalmente opaca el primer paso consistirá en cortar primero una sección muy fina de la muestra. Esto permitirá observarla en el microscopio mediante luz transmitida.
  2. Colocamos la sección que hemos cortado en el centro del portaobjetos con la ayuda de una pinzas. Si la muestra tiene un cierto volumen es recomendable utilizar un portaobjetos con una cavidad cóncava.
  3. Para mantener la muestra fija en su sitio la cubrimos con un cubreobjetos. Esto evita también que el objetivo llegue a tocar la muestra en caso de cometer algún error durante la manipulación del microscopio.

La ventaja de las muestras en seco es que no tienen problemas de deshidratación y pueden mantenerse preparadas para una observación posterior.

Preparación con tinción

Existen distintas técnicas para aplicar una tinción que se adecuan a los distintos tipos de muestras.

Si hemos preparado una muestra en fresco, podemos aplicar un tinte siguiendo los siguientes pasos:

  1. Depositamos unas gotas del tinte sobre uno de los bordes del cubreobjetos.
  2. Colocamos papel absorbente al lado opuesto del cubreobjetos para forzar el movimiento del tinte a través de la muestra.
  3. Una vez la muestra ha absorbido el tinte retiramos el papel absorbente.

Los tintes permiten aumentar el contraste y facilitar la observación de algunos detalles concretos de la muestra. Existen tintes de distintos colores y características adecuados para distintos tipos de muestras.

Muestras preparadas

El principal objetivo de preparar una muestra es proteger al espécimen de una posible degradación y pérdida de propiedades durante el tiempo que dura la observación. 

En algunos casos la muestra requiere un cierto nivel de hidratación y puede mantenerse en las condiciones adecuadas durante solo unos minutos. En el caso de las muestras en seco, la preparación puede mantenerse en su estado durante años y es posible realizar de nuevo una observación posterior si es necesario.

También existen procedimientos para fijar y mantener otro tipo de muestras, de modo que no sea necesario mantenerlas hidratadas si se quieren observar múltiples veces.

Este tipo de muestras pueden adquirirse en su estado preparado y son especialmente útiles para fines educativos.

Las muestras preparadas acostumbran a incluir muestras de elementos que de otro modo serían difícil de obtener. Por ejemplo, tejidos de animales, células, bacterias, etc.

Mediante la obtención de muestras que han sido preparadas por profesionales nos ahorramos los procesos laboriosos que serían necesarios para poder realizar una observación. Este tipo de muestras son perfectas para tener acceso a observaciones que requieren preparaciones mediante material profesional de laboratorio que a menudo no está disponible entre los aficionados.