El microscopio de contraste de fases es un tipo de microscopio que permite observar muestras vivas sin necesidad de usar técnicas de tinción.
La principal dificultad en la observación de células vivas es que estas son prácticamente transparentes. Por esto, si se miran a través de un microscopio convencional con luz transmitida resulta muy difícil o incluso imposible observar sus detalles y estructuras microscópicas.
La solución habitual a este problema ha sido utilizar técnicas de tinción. Esto implica la adición de algún tipo de colorante junto con la muestra que permite aumentar el contraste de los detalles que se quieren observar. Existen distintos colorantes y métodos de tinción adecuados para distintos tipos de observaciones.
El problema en la utilización de colorantes es que muchas veces su adición es incompatible con la vida de las células. Por esto, si bien son adecuados para observar células muertas, su uso es muchas veces limitado cuando se quieren mantener las células con vida.
Para este tipo de observaciones existe el microscopio de contraste de fases. Este microscopio manipula la luz de tal forma que es posible aumentar el contraste de la muestra observada. De este modo es posible observar estructuras que son invisibles a través de un microscopio convencional.
El microscopio de contraste de fases es un instrumento para poder observar todo tipo de muestras vivas (células, microorganismos, tejidos, …) sin necesidad de utilizar colorantes. La invención de este microscopio resultó en grandes avances en el campo de la biología ya que permitió la observación de procesos biológicos desconocidos hasta el momento.
En este artículo encontrarás una explicación básica de la naturaleza de las ondas de luz, necesaria para entender el funcionamiento del microscopio de contraste de fases. A continuación encontrarás también la definición de las principales partes de este tipo de microscopio así como una breve historia de su invención.
Características de una onda
El microscopio de contraste de fases funciona, como su nombre indica, aumentando el contraste de las fases de las ondas que llegan al objetivo. Esto significa que en este microscopio, el contraste de cada onda depende de su fase.
Para entender este concepto es necesario entender primero qué es la fase de una onda. Las ondas pueden caracterizarse a partir de tres parámetros: la amplitud, la frecuencia y la fase.
- Amplitud: La amplitud es la magnitud que alcanza la onda en su punto máximo. El valor de una onda está siempre contenido en un rango de valores limitado por su amplitud.
- Frecuencia: La frecuencia indica la cantidad de ciclos de una onda por unidad de tiempo y se mide en hercios. Por ejemplo, si una onda se repite 10 veces cada segundo su frecuencia es igual a 10 Hz.
- Fase: La fase es una medida de la posición de la onda respecto a un punto de referencia. La fase de una onda se puede medir en grados. Por ejemplo, si la diferencia de fase entre dos ondas es igual a 0° significa que las dos ondas están perfectamente sincronizadas. Si la diferencia de fase es de 180° significa que una onda está totalmente invertida respecto a la otra. Para el resto de valores encontramos un caso intermedio.
El microscopio de contraste de fases se basa en la existencia de una diferencia de fases entre las distintas ondas de luz que pasan a través de la muestra para generar la imagen de la observación.
Funcionamiento del microscopio de contraste de fases
El microscopio de contraste de fases funciona de forma similar a un microscopio compuesto convencional pero incluye también algunos elementos adicionales que le permiten detectar los cambios en las fases de las ondas.
En primer lugar hay un foco o fuente de luz que ilumina la muestra. Cuando esta luz atraviesa la muestra, sus ondas se ven afectadas de distintas formas. En consecuencia, estas ondas de luz se dividen en dos partes, conocidas como luz de iluminación y luz dispersada.
La luz de iluminación es la luz que atraviesa la muestra sin experimentar ningún cambio. El resto de ondas, conocidas como luz dispersada, experimentan un cambio de fase debido al índice de refracción del espécimen en la muestra. Esto es debido a que la luz viaja de forma un poco más lenta mientras pasa a través del espécimen. En consecuencia, cuando la luz sale de la muestra existe una diferencia de fase entre las ondas de la luz de iluminación y las de la luz dispersada.
La luz dispersada se retrasa aproximadamente unos 90 grados debido a su interacción con el espécimen. Además, su amplitud es significativamente menor que la luz de iluminación. La siguiente imagen muestra una representación de estas dos ondas:
El resultado total de estas dos ondas puede obtenerse a partir de su superposición. Este resultado se muestra de color verde en la siguiente imagen:
Como puedes ver, si las dos ondas se superponen prácticamente no existe diferencia entre la luz de iluminación y la onda total resultante. Esto significa que si observáramos esta señal de luz resultante, esta sería prácticamente igual a la señal de la luz de iluminación.
Esto sería lo que veríamos en un microscopio convencional. Es decir, una señal resultante equivalente a la señal de iluminación en la que no puede distinguirse la muestra.
El microscopio de contraste de fases se basa en manipular la luz de iluminación para aumentar así el contraste de la luz dispersada. Esto se consigue en dos fases, primero se introduce un cambio de fase en la luz de iluminación y a continuación se reduce su amplitud.
El cambio de fase en la señal de luz de iluminación se produce mediante un anillo de cambio de fase situado justo después del objetivo. Este anillo hace que únicamente la luz de iluminación se retrase 90 grados, mientras que la luz dispersada por el espécimen no se ve afectada. Las señales de luz después de pasar por este anillo de cambio de fase son las siguientes:
A continuación la luz de iluminación pasa también a través de un filtro que reduce su amplitud. En consecuencia, las dos señales finales que se obtienen son las siguientes:
Después de pasar por el filtro, la señal resultante es el resultado de la interferencia constructiva entre estas dos ondas. Esto significa que existe una superposición perfecta en los valles y las crestas de las ondas. En consecuencia, la onda de luz que se observa es muy distinta a la señal de iluminación original y muestra solo una alta amplitud en concordancia con la onda de luz dispersada por la muestra.
Simultáneamente, hay que tener en cuenta que en las regiones en los que no hay espećimen no se crea una onda de luz dispersada. La señal total en estos puntos es únicamente igual a la señal de iluminación manipulada y, por lo tanto, tiene una menor amplitud y menos contraste.
En conclusión, el microscopio de contraste de fases es un microscopio que traduce los cambios de fase de la luz de iluminación en cambios de amplitud. Las ondas que experimentan un cambio de fase mayor se verán con mayor amplitud mientras que las ondas que no experimentan cambios de fase se ven con una amplitud menor.
Una mayor amplitud implica que la onda se ve más brillante. Así, en el caso descrito, las ondas que atraviesan el espécimen tienen un mayor cambio de fase y, por lo tanto, se ven más brillantes que las ondas que atraviesan la muestra sin experimentar cambios de fase.
Diferencia entre el contraste de fases positivo y negativo
En el proceso descrito en el apartado anterior se ha explicado que la luz de iluminación que atraviesa la muestra es retrasada 90 grados mediante un anillo de cambio de fase. Esta configuración se conoce como contraste de fases negativo.
La imagen resultante en el contraste de fases negativo es una imagen en la que las partes del espécimen se ven más brillantes que sus alrededores.
Alternativamente, puede llevarse a cabo un proceso similar en que la luz de iluminación se avanza 90 grados respecto a la luz dispersada. Esta configuración se conoce como contraste de fases positivo.
En el contraste de fases positivo se produce una interferencia constructiva en los puntos en los que no hay espécimen mientras que la interferencia es destructiva en los puntos del espécimen.
En consecuencia, las observaciones con contraste de fases positivo muestran el espécimen en la muestras más oscuro que sus alrededores. El resultado es una inversión de la imagen respecto a la que se observa con la microscopía de contraste de fases negativo.
Partes del microscopio de contraste de fases
Las partes de un microscopio de contraste de fases pueden dividirse entre las del sistema mecánico y las del sistema óptico.
El sistema mecánico de este tipo de microscopio es equivalente al de un microscopio compuesto convencional. Este incluye la base, el brazo, el tubo, la platina, el revólver y los tornillos macrométrico y micrométrico.
La base es la parte inferior del microscopio que lo mantiene en su posición correcta. El brazo es la columna principal del microscopio que conecta la base y el tubo. Dentro del tubo se encuentran alineados los principales elementos ópticos del microscopio, incluyendo los oculares y el objetivo. La platina es la plataforma en la que colocamos la muestra y su posición vertical puede ajustarse mediante los tornillos macrométrico y micrométrico. Finalmente, el revólver es una pieza giratoria que permite seleccionar los distintos objetivos con distinto aumento.
El sistema óptico de los microscopios de contraste de fases es similar al de un microscopio convencional pero incluye también algunos elementos adicionales. Los elementos básicos son el objetivo, los oculares, el foco de luz, el condensador y el diafragma. Adicionalmente también es necesario un anillo de fase y un filtro.
La luz que emite el foco de luz es dirigida hacia la muestra con el condensador y regulada con el diafragma. Una vez ha atravesado la muestra la luz llega al objetivo, en el que se produce una primera etapa del aumento.
A continuación solo la luz de iluminación experimenta un cambio de fase debido a la presencia de un anillo de fase. Posteriormente el filtro reduce la amplitud o intensidad de esta señal. La luz dispersada por la muestra no se ve afectada por estos dos elementos. Finalmente, la combinación de la luz de iluminación y la luz dispersada llega a los oculares. Las lentes en los oculares representan una segunda etapa de aumento y a través de ellos el observador puede ver la muestra con un contraste variable en función de las fases.
Historia del microscopio de contraste de fases
La microscopía de contraste de fases fue inventada por el físico neerlandés Frits Zernike en 1932. Este gran invento hizo que le concedieran el premio Nobel de Física en 1953.
Los primeros microscopios de contraste de fase se empezaron a fabricar y comercializar en la década de 1940 por parte de la empresa Carl Zeiss AG en Alemania. Su impacto en el campo de la investigación científica fue inmediato, especialmente en el campo de la biología.
El desarrollo de la microscopía por contraste de fases propició que posteriormente se desarrollaran otras técnicas de microscopía basadas en principios similares. Una de ellas es la microscopía de contraste de interferencia diferencial, desarrollada por el físico polaco Georges Nomarski en 1952.
Resumen
- La microscopía de contraste de fases es una técnica de microscopía basada en traducir los cambios de fase de las ondas de luz que pasan a través de una muestra en cambios de amplitud.
- Este tipo de microscopía es especialmente útil para observar muestras biológicas vivas.
- Existen dos clases de microscopía por contraste de fases: positiva y negativa.
- En la microscopía por contraste de fases positiva el espécimen aparece más oscuro que el resto de elementos en la muestra. En la microscopía por contraste de fases negativa ocurre lo contrario.
- Dos elementos esenciales para construir un microscopio de contraste de fases son un anillo para inducir un cambio de fase en la luz y un filtro para reducir su intensidad o amplitud.
- Este tipo de microscopía fue inventada por el físico Frits Zernike en 1932.